Metodologia de evaluare a endopeptidazelor pancreatice: tripsina si alfachimotri

Adjuvantii asociati celor doua enzime au fost: polietilenglicol: 400, 4 000, 6 000; polisorbat: 20, 40, 60, 80; metil celuloza si lauril sulfat de sodiu. Ca metoda de lucru am folosit testarea cu film. Conditiile de lucru, temperatura, pH-ul, timpul etc. au fost stabilite de mine, sugerand ideea aplicarii acestei metode tuturor enzimelor care pot digera substrate proteice naturale. Metoda testarii cu film se bazeaza pe masurarea actiunii proteolitice a unei cantitati constante de enzima, folosind ca substrat un strat de emulsie de gelatina a unui film color developat. Emulsia aplicata pe film este colorata de la suprafata spre interior, si anume: primul strat de culoare purpurie, al doilea strat de culoare albastra, iar al treilea, verde. Cu cat activitatea proteolitica a enzimei este mai crescuta, culoarea spoturilor (obtinute prin digestia succesiva a straturilor colorate) trece de la purpuriu la verde, prezentand nuante intermediare (mai inchis sau mai deschis). Aprecierea intensitatii culorii se poate face cu aparate speciale sau chiar cu ochiul liber. S-a impus stabilirea concentratiilor celor doua enzime cu care sa se obtina spoturi colorate, comparabile intre ele, stabilindu-se conditiile de temperatura, necesare digestiei optime.

Modul de lucru:
1. solutie tampon cu valoare pH 7,5;
2. solutie cu enzime: 0,15 g de tripsina dizolvata in 15 ml de solutie de HCl, 0,0025 N si se aduce cu solutie tampon fosfat 7,5, la un volum total de 37,5. Aceasta solutie corespunde unei concentratii de 4 mg de enzima/ml.
Pentru alfachimotripsina se procedeaza la fel ca in cazul tripsinei, rezultand in final o solutie de concentratie 24 mg/ml.
Solutiile de adjuvanti in solutie apoasa (in apa distilata): toti adjuvantii, in concentratie de 2%, cu exceptia metilcelulozei, folosite in concentratie de 1%, pentru a evita viscozitatea mare care ar fi influentat experimentul.

Metoda de lucru:
In zece eprubete gradate, numerotate de la 1 la 10, s-a introdus 1 ml de solutie tampon 7,5. In prima eprubeta, considerata sistem de referinta, s-au adaugat 2 ml de apa distilata. In celelalte eprubete s-au introdus cate 2 ml din solutia de adjuvanti, preparata cum am aratat mai sus. Ordinea adjuvantilor a fost urmatoarea: in a doua eprubeta s-a adaugat polietilenglicol 400, apoi polietilenglicol 4 000, 6 000; polisorbat 20, 40, 60, 80 si metilceluloza. In a zecea eprubeta s-a introdus lauril sulfat de sodiu. De asemenea, in toate eprubetele s-a adaugat 1 ml de solutie de enzime, astfel ca, in fiecare eprubeta, in final, volumul sa fie de 4 ml. Cele zece eprubete au fost tinute la 37°C, timp de 15 minute, in ultratermostat.

Cu ajutorul unei micropipete s-a ales din fiecare proba cate o picatura, in paralel, pusa pe banda de film care avea stratul de emulsie la suprafata. Uterior, benzile de film au fost fixate in suporturi metalice. Filmele astfel pregatite au fost tinute in etuva termoreglabila, pentru digestie, timp de 45 de minute. Tripsina a fost tinuta la o temperatura de 30°C, iar alfachimotripsina, la 37°C. Dupa expirarea timpului de digestie, filmele au fost spalate (cu apa), apoi au fost scoase din ramele metalice si, in continuare, au fost tinute sub jet continuu de apa 10 minute. Astfel, au fost indepartate urmele impure ramase pe film in urma digestiei. Filmele, prelucrate in acest mod, au fost expuse la aer pentru a se usca. Rezultatele acestor cercetari sunt redate in imaginile 1 (tripsina) si 2 (alfachimotripsina).

Cercetarea a fost efectuata in Laboratorul de Biochimie al ICSM CF Bucuresti (Institutul pentru Controlul de Stat al Medicamentului si Cercetari Farmaceutice).

Dr. Farm. D. Hurduc