Comentarii asupra metodelor de evaluare a endopeptidazelor pancreatice: tripsina

In articolul respectiv am descris metoda folosita, si anume metoda testarii cu film, fiind una originala. Pentru a veni in sprijinul cercetatorilor din domeniu, ma simt obligat sa fac comentariile asupra limitelor acestei metodologii. Precizez ca asocierea cu adjuvanti sau alte substante active celor doua enzime pot fi testate cu ajutorul acestei metode. Rezultatele obtinute reprezinta informatii pur calitative, nereusind sa puna in evidenta eventualele modificari cu privire la viteza de umplere a locurilor/sitelor active din enzime, modificari deosebit de importante care evidentiaza cele mai discrete nuante de incompatibilitate. Acestea pot modifica mai mult sau mai putin valoarea terapeutica a enzimelor. Dupa testarea acestor enzime cu ajutorul substratului natural (emulsia de gelatina aplicata pe film), cercetarea trebuie continuata prin metoda cineticii enzimatice care da certitudinea compatibilitatii sistemelor asociate, metoda care foloseste substraturi sintetice, absolut specifice. Voi expune aceasta metoda in articolele viitoare.

Precizez de la inceput ca in cadrul metodei cu film (emulsie de gelatina colorata in straturi succesive, de la purpuriu, albastru, pana la verde) si pentru fiecare culoare, in functie de intensitatea activitatii enzimatice se pot obtine o multitudine de nuante, care se compara cu o culoare etalon. Aprecierea poate fi facuta cu ochiul liber sau cu un aparat adecvat. Aceasta metoda este superioara celei Anson, care folosea drept substrat hemoglobina cristalizata si altora, care utilizau albusul de ou, consemnandu-se timpul de digerare totala a acestor doua substraturi naturale. Metodele care folosesc substraturi proteice naturale sunt nespecifice, greu reproductibile si pot da indicatii asupra activitatii globale a enzimei proteolitice, fara sa poata arata caile prin care se realizeaza o astfel de activitate. Metodele moderne care intrebuinteaza substraturi sintetice specifice pot determina activitatea mai multor enzime proteolitice in amestec (1, 2, 3, 4, 5). Metoda cu film reuseste sa arate foarte clar chiar si o inhibitie totala a activitatii enzimatice, cazul lauril sulfatului de sodiu. Daca se compara cele doua filme prezentate in numarul din noiembrie al revistei Galenus, se observa ca, in cazul asocierii tripsinei, intensitatea culorii spoturilor (2-9) este perfect comparabila cu aceea a spotului de referinta (1), cu exceptia spotului 10. in ceea ce priveste filmul care arata activitatea alfachimotripsinei, inainte si dupa asociere, se observa ca spoturile 2-4 dau culori comparabile cu acelea ale spotului de referinta (1). Culorile spoturilor 5-9 reduc simtitor din activitatea enzimei, in timp ce spotul 10 inhiba total activitatea alfachimotripsinei, intocmai ca in cazul tripsinei. Se intelege ca metoda cu film este net superioara celei Anson si celei care foloseste albusul de ou. Este riscant sa fie trase concluzii definitive in ceea ce priveste acest model experimental care, asa cum am mai spus, reuseste sa ofere informatii calitative asupra fenomenului urmarit, fara sa poata pune in evidenta posibilele modificari in realizarea vitezei de reactie, dupa asocierea celor doua enzime. Metoda cu film foloseste reactivi obisnuiti si da rezultate reproductibile. Este utila in sensul ca ofera informatii care justifica sau nu continuarea sistemelor asociate luate in studiu prin metoda cineticii enzimatice. Asa cum bine se stie, rolul enzimelor in procesele vitale este de a cataliza biospecific reactiile organismelor vii fara de care viata nu este posibila. Conditiile de lucru si de conservare a enzimelor trebuie bine specificate, deoarece metoda cineticii enzimatice are nevoie de multa rigoare si acuratete din partea cercetatorilor. De exemplu, teoria statisticii matematice a ocuparii succesive a locurilor active din enzime se incadreaza intr-o teorie foarte complicata, de tip probabilistic.

Dr. Farm. D. Hurduc