Culegerea datelor experimentale prin metoda cineticii enzimatice

Voi expune intr-o anumita ordine partile lucrarii, pentru a usura lectura.
1. Aparatura folosita

Potentiometru electronic Quere Antares;

Ultratermostat Wobser;

Electrozi de calomel si sticla;

Agitator electromagnetic;

Biureta de 25 ml;

Vas de sticla cu pereti dubli;

Cronometru de precizie;

Dispozitiv cu lamela flexibila, de otel.

2. Materialele utilizate

Tripsina;

Alfachimotripsina;

L-lysine ethylester dihidrocloric (M.W. 259, 19 Mann, NY);

L-thyrosin ethylester dihidrocloric (M.W. 245, 70 Mann, NY);

NaCl p. a. Merck;

NaOH in rotuliss Merck;

Polietilenglicol 400, 4 000, 6 000 (Lobs. Chemie Wien);

Polisorbat 20, 40, 60, 80 (L-Lygt et Co. LTD Colombrook England);

Metilceluloza (Mann NY);

Lauril sulfat de sodium (Mann NY).

3. Metoda intrebuintata
Esterul etilic al lisinei, respectiv thyrosinei sunt scindate de tripsina, respectiv alfachimotripsina, iar gruparile carboxilat (-COO¯), puse in libertate, sunt determinate titrimetric cu o solutie de NaOH, de normalitate convenabila. Astfel rezulta, in functie de timp (minute), o concentratie in micromoli a -COO¯ eliberat, prin expresia V=dp/dt, si valorile vitezelor de stare stationara, la
diverse concentratii ale substratului.

4. Descrierea mecanismului de pH-statare
Pentru a se obtine o activitate enzimatica maxima, se cer, printre altele, doua conditii: mentinerea, pe toata durata experimentului, a temperaturii care s-a realizat cu ajutorul ultratermostatului Wobser si mentinerea pH-ului optim. Acest lucru m-a obligat sa aduc unele modificari potentiometrului electronic folosit. Acest aparat masoara si valorile de pH. Aparatul era prevazut cu o scala lineara, pozitionata orizontal, pe care erau trecute valorile de pH. Pe aceasta scala se deplaseaza un ac indicator, care face corp comun cu o mica talpa metalica. Am folosit aceasta constructie a aparatului, fixand cu ajutorul unor cleme, in dreptul pH-ului optim de activitate enzimatica, o bara metalica, pe care am sudat o lamela din otel foarte flexibil. Sistemul de pH-statare realizeaza obtinerea automata a caii de acces a solutiei de NaOH la mediul de titrare, in momentul introducerii enzimei in vasul de reactie, cand pH-ul optim este de 6,40 pentru tripsina si 6,25 pentru alfachimotripsina. Am stabilit aceste valori dupa tatonari prealabile. Calea de acces a solutiei de NaOH la vasul de reactie, respectiv tubularea de teflon ce leaga varful biuretei se realizeaza prin spatiul dintre lamela rasfranta si acul indicator. Dupa eliberarea gruparilor -COO¯, ca urmare a activitatii enzimei asupra substratului, pH-ul scade spre valori acide, fiind imediat corectat de o cantitate echivalenta de solutie de NaOH, prin deschiderea automata a caii de acces, mijloc prin care pH-ul solutiei ramane constant pe toata durata experimentului. Schema generala a aparaturii folosite este prezentata in fotografia 1, iar mecanismul de pH-statare, in fotografia 2.

5. Tehnica de lucru a cercetarii prin metoda cineticii enzimatice
In vasul de reactie cu pereti dubli, de capacitate 100 ml, se pipeteaza 10 ml de substrat LEE HCl pentru tripsina si TEE HCl pentru alfachimotripsina. Temperatura s-a mentinut la 25°C (± 0,05°C) cu ajutorul ultratermostatului. Reglarea pH-ului la 6,40 (tripsina) si 6,25 (alfachimotripsina) s-a realizat cu mecanismul de pH-statare. Calea de acces a solutiei NaOH 0,01N la vasul de reactie este aratata cu ajutorul mecanismului din fotografii. Sub agitare continua (cu ajutorul agitatorului electromagnetic), s-a adaugat substratului prezentat mai sus 0,50 ml de solutie de enzima, avand o concentratie determinata. pH-ul s-a reglat neintrerupt cu o solutie de NaOH 0,01N, cu ajutorul sistemului de pH-statare, descris si realizat de autorul articolului. Din momentul in care s-a adaugat solutia de enzima, s-a urmarit, timp de 10 minute, consumul mililitrilor solutiei de titrare (NaOH 0,01N). Citirea s-a facut la intervale de 1 minut. Intr-o prima serie de experimente, s-a lucrat pe substrat LEE HCl, respectiv TEE HCl puri, a caror concentratie s-a modificat intre 200 micromoli/ml, pana la 1 micromol/ml. Pasii intermediari de concentratie au fost: 200, 150, 100, 50, 30, 20, 15, 10, 5, 3, 2, 1,50 si 1 micromol/ml. In alta serie de experimente, s-a folosit aceeasi concentratie de substante, asociata insa cu adjuvanti. Concentratia tripsinei, in toate variantele experimentale a fost de 1,25% mg si 2,50% mg, pentru alfachimotripsina. Taria ionica a tuturor solutiilor folosite a fost asigurata de solutia de NaCl 0,25M. Din experimente au rezultat mililitri de solutie de NaOH 0,01N, consumati in timp de 1 minut, respectiv 10 minute, pentru toate variantele studiate. Rezultatele experimentale s-au exprimat grafic P=P (t).
In decursul titrarii, volumul de reactie s-a modificat mereu. Deoarece in ecuatiile cineticii intervin concentratii, s-a determinat concentratia in micromoli/ml de -COO¯, eliberati in functie de timp, cu ajutorul formulei P (t)= 10 N (t)/10 +N (t), unde N (t) sunt mililitri de NaOH, consumati pana la timpul (t). 10/10 +N(t) este factorul care tine cont de dilutia realizata prin adaugarea reactivului de titrare. Prelucrarea datelor experimentale o vom face, sub forma rezumata, intr-un nou articol. Chimia enzimelor este o parte foarte complexa a chimiei generale, cu multa chimie fizica la baza, incat cercetatorii trebuie sa stapaneasca foarte bine modul de comportare a acestor entitati si transpunerea rezultatelor experimentale in practica. Multe enzime biocatalizatoare sunt folosite ca medicamente, asociate cu adjuvanti, uneori si cu alte substante active. Studiul acestor entitati trebuie bine stapanit, pentru a proteja activitatea integrala a enzimei. De asemenea, laboratoarele trebuie sa aiba specialisti care sa cunoasca foarte bine convertirea diferitelor unitati enzimatice (de culoare, de gramaj, unitati spectrofotometrice, unitati Schwrt-Takenaka etc.). Totodata, farmacistii trebuie sa cunoasca si sa respecte intocmai conditiile de conservare a medicamentelor care au continut enzimatic. De asemenea, trebuie sa sfatuiasca bolnavii care folosesc astfel de medicamente sa nu le administreze in acelasi timp cu altele.

Dr. Farm. D. Hurduc