Tehnologia ADN recombinat in obtinerea insulinei

Tehnologiile de inginerie genetica au luat amploare in ultimul timp, fiind folosite cu succes in obtinerea de enzime, hormoni, imunomodulatori sau alte substante necesare in terapiile de substitutie. Aceste metode au permis obtinerea, prin tehnologia ADN recombinat, unor cantitati crescute de substanta care, prin metode obisnuite, ar fi fost extrase cu implicarea unor costuri ridicate si in cantitati insuficiente.
O adevarata realizare pe piata farmaceutica este obtinerea prin inginerie genetica a insulinei.

Aceasta reprezinta o medicatie de substitutie in diabetul juvenil si, la adulti, in formele severe de diabet.

Rolul insulinei in organism
Insulina este un hormon polipeptidic cu mare impact asupra metabolismului, intervenind chiar in procesele senzoriale si in cele cognitive. In metabolismul glucidic, insulina asigura cresterea depozitelor de glicogen si scade glicogenoliza hepatica. In metabolismul proteic favorizeaza sinteza proteinelor in muschi prin usurarea transportului aminoacizilor si stimularea sintezei ribozomale in celulele musculare. De asemenea, stimuleaza sinteza trigliceridelor si scade lipoliza prin inhibarea lipazei din adipocite.
In celulele beta-Langerhans din portiunea endocrina a pancreasului (care reprezinta doar 2% din intreaga masa pancreatica), insulina este sintetizata din precursorul ei, proinsulina, sub actiunea enzimelor proteolitice, precum prohormon convertaza si carboxipeptidaza.
Insulina este produsa de celulele pancreatice si eliberata sub actiunea a numerosi stimuli. Eliberarea nu este continua, ci oscileaza (chiar si in cursul digestiei) la 3-6 minute. Astfel, este impiedicat procesul de down-reglare a receptorilor pentru insulina, fiind facilitata metabolizarea sa de catre ficat.
In celulele asupra carora actioneaza, insulina transmite un semnal de transductie a carui consecinta este captarea si stocarea glucozei sub forma de glicogen de catre ficat si muschi. Cand insulina lipseste sau se gaseste in organism in cantitate scazuta, glucoza nu mai este consumata. Drept sursa de energie este folosit tesutul adipos. Apare astfel diabetul zaharat tip I, dependent de aportul exogen de insulina.

Obtinerea insulinei prin recombinare genetica
Obtinerea insulinei cu ajutorul bacteriilor, mai precis prin intermediul Escherichiei Coli, prezinta, fata de cea obtinuta prin extractie din pancreasul animal, avantajul ca nu induce retinopatii, nefropatii. Totodata, nu are potential alergen. Are aceleasi proprietati ca si insulina umana pancreatica, fiind cea mai pura insulina existenta pe piata farmaceutica pana in prezent. Mai mult, studiile clinice au aratat ca este mai eficienta decat insulina umana.
Exista in prezent doua procedee de obtinere a insulinei prin tehnologia clonarii genelor. Primul se bazeaza pe clonarea genelor corespunzatoare celor doua catene ale insulinei, sintetizate chimic, iar al doilea, pe clonarea ADN complementar corespunzator proinsulinei. In ambele cazuri, clonarea se face in bacteria E. coli.
Toate tehnologiile de biosinteza care folosesc microorganisme manipulate genetic au probleme cu stabilitatea mutantului, deoarece toti mutantii sunt instabili, iar dupa un anumit numar de multiplicari revin la forma parenterala. Problema stabilitatii devine esentiala atunci cand se lucreaza in flux continuu sau cu volume mari. In cazul utilizarii E. coli, aceasta genereaza 60 de cicluri de viata in care produce insulina, fiind capabila sa produca 12 000 L de mediu de cultura.

Formulari farmaceutice ale insulinei
In terapeutica, insulina se masoara in unitati. O unitate de insulina se defineste ca fiind cantitatea necesara pentru a scadea glicemia la iepure, pe nemancate, la 45 mg/100mL. Pentru preparatele purificate, unitatea se raporteaza la greutate. 1 mg de insulina standard contine 24-28 de unitati. Preparatele utilizate in terapeutica au un continut de 40 sau 100 unitati/mL.
Formularea farmaceutica a insulinei a prezentat probleme la inceput, din cauza instabilitatii sub forma de solutie la conservare, pe o perioada mai mare de timp. Molecula de insulina are o sarcina negativa la pH neutru, iar formulata ca solutie cu pH acid devine instabila in timp, din cauza unui proces de dezamidare, cu pierderea activitatii biologice. Deoarece in celulele pancreatice este stocata sub forma de hexameri cu zinc, s-a recurs la stabilizarea chimica a acesteia prin adaugarea a aproximativ 0,4% zinc si a conservantilor fenolici.
Formularile normale (simple) neutre, numite INSULINA REGULAR, prezinta o activitate maxima a insulinei dupa 2-3 ore, cu o durata maxima de 6-8 ore.
INSULINA LISPRO, obtinuta prin schimbarea pozitiilor lizinei si a prolinei din structura acesteia, prezinta un profil mai rapid de actiune, avand activitate maxima dupa aproximativ o ora. Au fost concepute si formulari solubile care pot fi utilizate in pompe externe sau implantate.
O alta formulare farmaceutica a insulinei este insulina cu actiune intermediara, INSULINA NPH sau INSULINA LENTE. Insulina NPH se gaseste co-cristalizata cu protamina, proteina cu caracter puternic bazic. Prezinta o stare latenta de 1-2 ore si o durata de actiune de 18-24 de ore, variind in functie de doza, locul injectarii si temperatura. Insulina NPH poate fi amestecata ex tempore cu INSULINA REGULAR in raport de 70/30 sau 50/50, oferind un mai bun control al glicemiei.
INSULINA ULTRALENTE este singura insulina cu actiune prelungita, avand o durata de actiune de pana la 28 de ore. Insulina recombinata se gaseste pe piata farmaceutica in flacoane de 10 mL, cu o concentratie standard de 100 unitati/mL.

Efecte nedorite ale farmacoterapiei cu insulina
Uneori, efectul insulinei poate scadea sau chiar disparea, fenomen numit insulino-rezistenta. Acest lucru este provocat de aparitia anticorpilor specifici, mai ales la insulina bovina insuficient purificata. Substantele care se pot regasi ca impuritati sunt fie produsi secundari rezultati pe parcursul procesului de obtinere (dezamidoinsulina), fie compusi intermediari sau agregate de insulina sau proinsulina. Un preparat purificat este considerat cel care nu contine mai mult de 10 ppm de proinsulina.
Ca orice medicament, insulina poate provoca reactii adverse. O reactie frecvent intalnita este hipoglicemia. Aceasta se poate instala brusc, cu transpiratii reci, paloare si hipotermie, dureri de cap, tahicardie, slabiciune, stare de confuzie. Din aceasta pricina, trebuie informat medicul curant de aparitia starilor hipoglicemice, deoarece acestea pot provoca leziuni cerebrale si chiar moarte. In cazul aparitiei unei hipoglicemii severe, pacientul isi va reveni mai repede din starea de inconstienta daca i se administreaza o injectie cu glucagon, precedata de o gustare dulce, cat mai repede posibil dupa recapatarea cunostintei.
Administrarea insulinei concomitent cu alte medicamente poate necesita o ajustare a dozei. Este necesara informarea medicului diabetolog de orice alta medicatie care implica antidiabetice orale, inhibitori MAO, inhibitori ai enzimei de conversie, glucocorticoizi, beta-adrenergice, hormoni tiroidieni si chiar aspirina.

Bibliografie:
1.Cristea A. N., Tratat de farmacologie, Editura Medicala, 2008;
2.Note de curs, Biotehnologii si industrie farmaceutica;
3.Chang X., Jorgensen A. M., Bardrum P., Led J. J. (August 1997), Solution structures of the R6 human insulin hexamer, Biochemistry 36(31).
4.www.rxlist.com/humalog-drug.htm;
5.www.medical-dictionary.thefreedictionary.com
6.http://www.medscape.com/pharmacists

Mirela Popa, Studenta anul V,
UMF „Carol Davila”, Bucuresti