Acasă » Practică medicală » Determinarea activitatii antioxidante a unor extracte glicerinohidroalcoolice

Practică medicală

Determinarea activitatii antioxidante a unor extracte glicerinohidroalcoolice

Determinarea activitatii antioxidante prin Metoda SOD

Obiective

Aparitia unor procese degenerative, este corelata in biologia moleculara cu existenta unui surplus nociv de radicali liberi, promotori ai unor procese oxidative dezastruoase organismului. Existenta in plante a unor compusi cu proprietati antioxidante, si continut ridicat cu compusi captatori ai radicalilor liberi (derivati carotenoidici, polifenolici, flavonici, antociani, acizi grasi nesaturati, vitamine, enzime si cofactori) a stimulat si interesul pentru utilizarea acestora in fitoterapia profilactica si curativa.

Rolul antioxidantilor consta in distrugerea radicalilor liberi ai celulei care au un efect negativ asupra organismelor vii. Un rol aparte in neutralizarea efectelor stresului oxidativ ii revine enzimei superoxiddismutaza (SOD). Superoxiddismutaza (SOD) reprezinta o metaloenzima cu organizare structurala subunitara. SOD este reglatorul principal al proceselor de oxidare in celula. Aceasta enzima catalizeaza reactia de recombinare a radicalilor O₂. Aplicarea terapiei antioxidante cu utilizarea SOD este eficienta in tratarea diverselor stari patologice ale organismului uman, dar si pentru prevenirea si dezvoltarea acestora (cu formarea peroxidului de hidrogen si oxigenului triplet).[ 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10]

In cazul nostru s-a urmarit determinarea capacitatii antioxidante a extractelor glicerinohidroalcoolice in dilutie 1DH din muguri de coacaz negru, din amenti de salcie, din muguri de mesteacan pufos, din mladite de afin.

Dozarea activitatii superoxid dismutazei

Materiale si metoda

Metoda descrisa de Winterbourn si colaboratorii se bazeaza pe capacitatea superoxid dismutazei de a inhiba reducerea sarii de tetrazoliu-Nitro Blue Tetrazoliu (Nitro BT) cu radicali superoxid. O unitate enzimatica reprezinta cantitatea de enzima care produce 50% inhibitie in conditii standard.Viteza si temperatura de reactie. Radicalii superoxid sunt generati in mediul de reactie prin fotoreducerea riboflavinei.

Reactivi si solutii

Solutie de Nitro BT (clorura de 2,2’-di(p-nitrofenil)-5,5’-difenil-3,3’-(3,3’-dimetoxi-4,4’-difenil ditetrazoliu)1,5Mm
Solutie EDTA Na₂ 0,1M adusa la pH 7,8 cu NaOH 1 N
Solutie riboflavina 0,12 Mm
Solutie tampon fosfat de potasiu 36 mM ph 7,8
Extract proteic realizat din ficat

Modul de lucru

Mediul de reactie cuprinde: 2,55 mL solutie tampon; 0,20 mL solutie EDTA Na₂; 0,10 mL solutie enzima; 0,10 mL solutie Nitro BT; 0,05 mL solutie riboflavina.

Paralel se realizeaza si un martor cu aceeasi compozitie, cu exceptia solutiei enzimatice. Martorul si proba sunt supusi iluminarii timp de 5 minute la un bec de neon, dupa care se citeste extinctia la 560 nm.

Calculul rezultatelor

In martor (lipseste enzima) radicalii superoxid, formati prin fotoreducerea riboflavinei, reduc sarea de tetrazoliu la un formazan, intensitatea culorii albastre fiind maxima (100% inhibitie).

In proba, superoxid dismutaza descompune o parte din radicalii superoxid iar cantitatea de formazan formata este mai mica.

Procentul de inhibitie realizat de enzima din proba se calculeaza utilizând relatia:

100 – DO_proba/ DO_martorx 100 = a% inhibitie

Pentru exprimarea rezultatelor experimentale in unitati enzimatice a x inhibitie se raporteaza la 50 si la mg/mL proteina in proba:

U/mg = a% inhibitie / 50% inhibitie.mg/mL

Apoi activitatea antioxidanta s-a determinat prin procentul de inhibitie al reactiei de peroxidare al lipidelor din creierul de cobai in prezenta acidului ascorbic. Produsul reactiei de peroxidare lipidica, malondialdehida a fost determinata prin reactia de formare a unui complex colorat cu acidul tiobarbituric citind absorbanta probelor spectrofotometric la λ = 532 nm [2].

Determinarea activitatii antioxidante se efectueaza pe probele diluate de la dilutiile 1:1 la 1:1000, in functie de activitatea antioxidanta folosind metoda biologica.

Material si metode

Tampon Tris-PO₄pH=7,4 C_N=0.05N pH=7,5
HCl (R) C_N=0.05N
Acid ascorbic (R)
Creier de cobai (substrat enzimatic)
Solutia acid tricloracetic solutia 10%
Solutia acid tricloracetic 2.5%
Solutia acid tiobarbituric 0.1% adusa la pH=7.8 cu NaOH 1N

Paralel, se realizeaza un martor cu aceeasi compozitie, cu exceptia solutiei enzimatice. Martorul si proba sunt supusi pe baia de apa la fierbere timp de 15 minute, dupa care se citeste extinctia la λ=532nm.

Calculul rezultatelor

In martor (lipseste enzima) radicalii liberi, formati rezultati din reactia dintre peroxizi, rezulta in urma actiunii acidului ascorbic asupra lipidelor din creierul de cobai cu acidul tiobarbituric.

In proba rezultata in urma actiunii acidului ascorbic asupra lipidelor din creierul de cobai cu acidul tiobarbituric, bazandu-se pe cantitatea de determinarea spectofotometrica a malondialdehidei.

Procentul de inhibitie realizat de enzima din proba se calculeaza utilizand relatia:

inh%(AE)=100 – (DO_proba-DO_martor/ DO_proba) x100

Tabelul urmator prezinta inhibitiile procentuale ale peroxidarii lipidelor .

Tabelul nr.1. Inhibitia procentuala a peroxidarii lipidelor la diferite dilutii

V/V Dilutii	1/10	1/100	1/500	1/1000	1/10000	1/100000	Peroxidaza U/ml
Extract glicerinohidroalcoolic din muguri de coacaz negru (dilutie 1DH)	99%	98%	40%	25%	_	_	_
Extract glicerinohidroalcoolic din amenti de salcie(dilutie 1DH)	99%	98%	40%	25%	_	_	_
Extract glicerinohidroalcoolic din muguri de mesteacan pufos(dilutie 1DH)	98%	90%	40%	25%	_	_	_
Extract glicerinohidroalcoolic din mladite de afin(dilutie 1DH)	90%	80%	30%	25%	_	_	_
Extract glicerinohidroalcoolic din mladite de rozmarin(dilutie 1DH)	99%	98%	40%	25%	_	_	_

Rezultate si discutii

S-au realizat inhibitii la diferite procente ale peroxidarii lipidelor la gemoderivatele 1DH din muguri de coacaz negru, muguri de mesteacan pufos, mladite de afin, amenti de salcie si mladite de rozmarin

Reactia de peroxidare lipidica este o metoda de determinare a potentialului oxidativ, utilizata pentru caracterizarea produselor de tip extract glicerinohidroalcoolic 1 DH. Reactia de peroxidare indusa de acidul ascorbic asupra omogenatului de creier de cobai, a urmarit inhibitia peroxidarii lipidelor de catre extractele glicerinohidroalcoolice 1DH. Malonaldehida rezultata in urma peroxidarii, s-a determinat spectrofotometric la 532 nm prin reactia cu acid tiobarbioturic. Rezultatele sunt prezentate in tabelul de mai sus.(Tabelul nr.1).

Procentul de inhibitie al peroxidarii este proportional cu dilutia extractului glicerinohidroalcoolic ajungand la 98 %, 90%, 80% la extractul glicerinohidroalcoolic din amenti de salcie, din muguri de mesteacan pufos si mladite de afin la o dilutie de 1/10 a extractelor glicerinohidroalcoolice 1DH si la 98% la extractul glicerinohidroalcoolic din muguri de coacaz negru 1DH diluat si extract glicerinohidroalcoolic din mladite de rozmarin 1DH diluat. Inhibitia peroxidarii se intalneste si la dilutie de 1/100.